Estudio del armazón arquitectónico y del sistema vascular de los tumores neuroblásticos

Los pacientes con tumores neuroblásticos presentan una evolución clínica heterogénea, desde la regresión espontánea hasta una alta propensión para la diseminación metastática generalizada. Aunque la aplicación de una clasificación de riesgo pre-tratamiento bien definida tiene un papel central en la mejora de la supervivencia durante los últimos años, han de llevarse a cabo más avances para mejorar la superviencia de los pacientes en general y específicamente el subgrupo de pacientes de alto riesgo. El estudio morfológico del tejido tumoral está contribuyendo a dicha mejora. La categoría histológica o el porcentaje de estroma tumoral, así como el grado de diferenciación de las células neuroblásticas, determinadas por el patólogo con el microscopio óptico, son factores con un papel importante en el diagnóstico y el pronóstico de los pacientes. Actualmente, dada la relevancia de la matriz extracelular tumoral en la biotensegridad y la mecanotransducción, su arquitectura y la topología de sus elementos, así como su interacción están siendo cada vez más considerados. Su cuantificación y caracterización con técnicas de imagen microscópicas empiezan a ser utilizadas. Nuestra hipótesis es que el destino de una célula tumoral neuroblástica es complejo y entre otros factores, está determinado por las características de un grupo de elementos estructurales no celulares de la matriz extracelular. Además pensamos que aplicando los patrones derivados del análisis morfométrico de estos elementos y asociandolos al impacto de los factores pronósticos conocidos, se mejorará la supervivencia de los pacientes. Nuestro objetivo es el desarrollo de técnicas morfométricas para caracterizar distintos elementos del andamiaje de la matriz extracelular y de la vascularización con el fin de encontrar usos potenciales como nuevos marcadores con valor pronóstico para mejorar la estratificación de los pacientes, o como dianas terapéuticas para ser capaces de remodelar los elementos aberrantes del andamiaje tisular, incluyendo la microvascularización. Hemos construido 19 micromatrices de tejido incluyendo más de 500 neuroblastomas, que fueron teñidos con alzul alcián a pH 2,5, Gomori, tricrómico de Masson, orceína y anti-CD31 para glicosaminoglicanos, fibras de reticulina, fibras de colágeno tipo I, fibras elásticas y vasos sanguíneos, respectivamente. Las laminillas fueron digitalizadas con un escáner de preparaciones y distintos algoritmos de análisis de imagen fueron diseñados o personalizados para detectar y caracterizar la cantidad, el tamaño y la forma de los distintos elementos estudiados de la matriz extracelular. Estos parámetros se relacionaron con los distintos subgrupos de neuroblastoma, teniendo en cuenta varias características clínicas, histopatológicas y genéticas. Los resultados obtenidos mostraron que las fibras de reticulina eran los componentes mayoritarios del andamiaje fibroso y que la abundancia y arquitectura de la microvascularización era relevante para el pronóstico de los niños con neuroblastoma. Una matriz extracelular rígida y poco porosa con vasos sanguíneos con luces irregulares se detectó principalmente en tumores pertenecientes a pacientes con pronóstico desfavorable. Un subgrupo de la cohorte de alto riesgo con muy mala supervivencia pudo ser definido por variables morfométricas de las fibras de reticulina y de los vasos sanguíneos. Concretamente, las muestras con un mayores áreas ocupadas tanto por fibras de reticulina formando grandes redes entrecruzadas, ramificadas y de organización compleja, como por vasos sanguíneos, junto con capilares y vasos tipo sinusoide de forma irregular y vénulas y arteriolas dilatas, estaban asociadas a un pronóstico muy desfavorable. En esta cohorte, las células con amplificación del gen MYCN conllevaron cambios topológicos detectables en relación a las fibras de reticulina y los vasos sanguíneos. Podemos concluir que es possible y conveniente cuantificar la sustancia fundamental, caracterizar el andamiaje fibroso y el sistema vascular de los tumors neuroblásticos gracias al análisis morfométrico de imágenes microscópicas. Algunas de las características morfométricas relaciondas con los distintos elementos de la matriz extracelular estudiados podrían ser usadas como ayuda diagnóstica del grupo de pacientes con riesgo ultra alto, tras estudiar una mayor cohorte. Los resultados obtenidos sugieren la necesidad de realizar trabajos multidisciplinarios para integrar de estos estudios a nivel internacional y que la información morfométrica de los elementos de la matriz extracelular, incluyendo el sistema vascular, pueda ser utilizada para una terapia basada en la mecanotransducción.Neuroblastic tumor patients present an heterogeneous clinical evolution, from spontaneous regression to a high propensity for widespread metastatic dissemination. Although the application of a well-defined pre-treatment risk classification plays a central role in the improvement of survival during the last years, more efforts must be done to improve patient’s survival in general and specifically in the subgroup of high risk patients. The morphological study of the tumoral tissue is contributing to such improvement. The histological category or the percentage of tumoral stroma, as well as the degree of differentiation of neuroblastic cells, evaluated by the pathologist with light microscopy, are factors that play a role in the diagnosis and prognosis of the patients. Given the role of tumoral extracellular matrix in biotensegrity and mechanotransduction, its architecture and the topology of its elements, as well as their interaction are being increasingly considered. Its quantification and characterization with microscopic image techniques start to be used. We hypothesize that the destiny of a neuroblastic tumor cell is complex and, is in part directed by characteristics of a set of non-cellular extracellular matrix structural elements. Additionally, we think that the application of the patterns derived from the morphometric analysis of such elements and their association with the impact of the known prognostic factors, patient’s survival will be improved. We aim to develop morphometric techniques to characterize different extracellular matrix scaffolding and vascular elements to find out potential uses as new prognostic markers for a better pre-treatment stratification of the patients or as therapeutic targets to be able to remodel the aberrant elements of the tissue scaffolding, including microvascularization. We constructed 19 tissue microarrays including more than 500 neuroblastomas which were stained with alcian blue pH 2.5, Gomori, Masson’s trichrome, orcein and anti-CD31 for glycosaminoglycans, reticulin fibers, collagen type I fibers, elastic fibers and blood vessels, respectively. The slides were digitized with a whole-slide scanner and different image-analysis algorithms were designed or customized to specifically detect and characterize the amount, the size and the shape of the different extracellular matrix elements studied. These parameters were related to different neuroblastoma subgroups, taking into account several clinical, histopathological and genetic features. The results obtained showed that reticulin fibers were the main components of the fibrous scaffolding and that microvasculature amount and architecture were relevant in the prognosis of neuroblastoma patients. A stiff and poorly porous extracellular matrix with irregularly-shaped vascular lumens was mainly detected in tumors belonging to patients with unfavorable prognosis. A subgroup of the high risk cohort with very poor survival could be defined by morphometric variables of reticulin fibers and blood vessels. Specificallly, those samples with high stained areas occupied by reticulin fibers forming large, crosslinking, branching and disorganized networks and by blood vessels, as well as with irregularly-shaped capillaries and sinusoid-like vessels and dilated venules, presented a very unfavorable survival. In this cohort, cells with MYCN gene amplification led to detectable topological changes regarding reticulin fibers and bood vessels. We can conclude that it is possible and convenient to quantify the fundamental substance and characterize the architecture of the fibrous scaffolding and the vascular system of neuroblastic tumors by means of the morphometric analysis of microscopic images. Some of the morphometric features related to the different extracellular matrix elements studied could be used as a diagnostic support for the ultra-high risk group of patients, after studying a larger cohort. The obtained results suggest the need of developing multidisciplinary efforts for an international integration of these studies, and that the morphometric information of the elements of the extracellular matrix, including the vascular system, could be used for a therapy based on mechanotransduction

Digital morphometric analysis of skin elements.

Objetivo: Proponer el uso de la infraestructura digital morfométrica para la cuantificación microscópica objetiva de elementos celulares y de la matriz extracelular en heridas y cicatrizaciones de la piel. Descripción de posibles usos, ventajas e inconvenientes. Presentación de una propuesta en diversos cortes histológicos del sistema tegumentario. Material y métodos: En el ejemplo empleado se utilizaron cortes de piel fina sana teñidos con técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas. Las muestras se digitalizaron con el escáner Panoramic MIDI (3D Histech Ltd.) y las imágenes obtenidas se analizaron con el software Panoramic Viewer v.1.15 (3D Histech Ltd) para cuantificar elementos celulares y con el software Image Pro-plus v.6.0 (Media Cybernetics) para cuantificar y caracterizar elementos fibrosos de la matriz extracelular. Resultados: Por un lado cuantificamos las células CD1a+ de la epidermis y la dermis detectando 164 elementos positivos por mm2 y 2.039 elementos negativos por mm2 ; representando el 7,46% de las células cutáneas y, por tanto, las células de Langerhans epidérmicas y macrófagos dérmicos. También valoramos fibras de la matriz extracelular en las capas papilar y reticular de la dermis. En relación con las fibras elásticas, se cuantificó un número mayor por unidad de área con mayor porcentaje de área teñida en la dermis profunda o capa reticular. Mientras que, para las fibras de colágeno, se detectó mayor cantidad por unidad de área con menor porcentaje de área teñida en la dermis superficial o capa papilar. Con respecto a las características de las fibras elásticas en las dos capas, distinguimos que formaban redes más ovoides, estaban dispuestas de forma más oblicua a la epidermis y eran más cortas, estrechas y rectilíneas en la dermis papilar. Para las fibras de colágeno detectamos que formaban haces más redondeados, estaban dispuestos de forma más perpendicular a la epidermis y eran más cortos, estrechos y ondulados en la dermis papilar. Conclusiones: La cuantificación objetiva de células y fibras de la matriz extracelular en imágenes microscópicas digitalizadas proporciona una herramienta rápida, fiable y discriminativa que puede ser útil para numerosos estudios cutáneos. Palabras Clave: Herida - Cicatrización - Estudio Histológico - Piel

NeuPAT: an intranet database supporting translational research in neuroblastic tumors will be published in Computers in Biology and Medicine

Translational research in oncology is directed mainly towards establishing a better risk stratification and searching for appropriate therapeutic targets. This research generates a tremendous amount of complex clinical and biological data needing speedy and effective management. The authors describe the design, implementation and early experiences of a computer-aided system for the integration and management of data for neuroblastoma patients. NeuPAT facilitates clinical and translational research, minimizes the workload in consolidating the information, reduces errors and increases correlation of data through extensive coding. This design can also be applied to other tumor types.This work was supported by RD06/0020/0102 and PI10/0015 (ISCIII & ERDF); 396/2009 (FAECC).We are grateful to Mr.D. Harrison for assistance with English language editing.Villamon Ribate, E.; Piqueras, M.; Meseguer Anastasio, JE.; Blanquer Espert, I.; Berbegall Beltrán, AP.; Tadeo Cervera, I.; Hernández García, V.... (2013). NeuPAT: an intranet database supporting translational research in neuroblastic tumors will be published in Computers in Biology and Medicine. Computers in Biology and Medicine. 43(3):219-228. doi:10.1016/j.compbiomed.2012.11.011S21922843

Circadian PERformance in breast cancer: a germline and somatic genetic study of PER3VNTR polymorphisms and gene co-expression.

Polymorphisms in the PER3 gene have been associated with several human disease phenotypes, including sleep disorders and cancer. In particular, the long allele of a variable number of tandem repeat (VNTR) polymorphism has been previously linked to an increased risk of breast cancer. Here we carried out a combined germline and somatic genetic analysis of the role of the PER3VNRT polymorphism in breast cancer. The combined data from 8284 individuals showed a non-significant trend towards increased breast cancer risk in the 5-repeat allele homozygous carriers (OR = 1.17, 95% CI: 0.97-1.42). We observed allelic imbalance at the PER3 locus in matched blood and tumor DNA samples, showing a significant retention of the long variant (risk) allele in tumor samples, and a preferential loss of the short repetition allele (p = 0.0005). Gene co-expression analysis in healthy and tumoral breast tissue samples uncovered significant associations between PER3 expression levels with those from genes which belong to several cancer-associated pathways. Finally, relapse-free survival (RFS) analysis showed that low expression levels of PER3 were linked to a significant lower RSF in luminal A (p = 3 × 10-12) but not in the rest of breast cancer subtypes